Microscopía de fluorescencia de campo amplio
La microscopía de fluorescencia de campo amplio es una técnica que permite obtener imágenes de alta fidelidad, con una resolución espacial de λ/2, y es utilizada ampliamente en ciencias de la vida pues permite adquirir imágenes de muestras biológicas con poca degradación de la misma. A continuación mostramos un esquema de un microscopio de fluorescencia básico y un microscopio con dos láseres. Este último utilizado también en experiencias de Super-resolución de campo amplio (o wide field), pudiendose obtener una resolución de hasta λ/10 luego del procesado de las imágenes.Haga click sobre los íconos para conocer más!
Láser de excitación
Una fuente de luz láser para la excitación de la muestra permite una alta selectividad en la longitud de onda (o color),
además de disminuir las perdidas de luz y evitar la óptica de enfoque necesaria cuando se utilizan lámparas. En la actualidad existe una variedad enorme de
láseres que satisfacen las necesidades del usuario tanto en longitud de onda como en potencia lumínica. Los láseres más usados para estas aplicaciones
son los diodos, los de estado sólido bombeado por diodo (DPSS), y los sintonizables como ser el Ti:Sapphire.
Empresas proveedoras:
Una fuente de luz láser para la excitación de la muestra permite una alta selectividad en la longitud de onda (o color),
además de disminuir las perdidas de luz y evitar la óptica de enfoque necesaria cuando se utilizan lámparas. En la actualidad existe una variedad enorme de
láseres que satisfacen las necesidades del usuario tanto en longitud de onda como en potencia lumínica. Los láseres más usados para estas aplicaciones
son los diodos, los de estado sólido bombeado por diodo (DPSS), y los sintonizables como ser el Ti:Sapphire.
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Filtro espacial
El filtro espacial a la salida del láser se utiliza para obtener el modo TEM00 del láser y lograr mayor uniformidad en iluminación de la muestra.
El filtro consiste en un pinhole y dos lentes que, correctamente seleccionadas, permiten ensanchar el haz para lograr una iluminación más uniforme.
En el caso que se haga microscopia de campo amplio (o wide field) se utiliza además una lente (BFP) de manera de enfocar el haz sobre el plano focal trasero del objetivo (Back Focal Plane),
evitando así enfocar el haz sobre la muestra.
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El filtro espacial a la salida del láser se utiliza para obtener el modo TEM00 del láser y lograr mayor uniformidad en iluminación de la muestra.
El filtro consiste en un pinhole y dos lentes que, correctamente seleccionadas, permiten ensanchar el haz para lograr una iluminación más uniforme.
En el caso que se haga microscopia de campo amplio (o wide field) se utiliza además una lente (BFP) de manera de enfocar el haz sobre el plano focal trasero del objetivo (Back Focal Plane),
evitando así enfocar el haz sobre la muestra.
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Cubo de filtros
El cubo de filtros es la parte fundamental de un microscopio de fluorescencia pues permite separar la señal fluorescente y consiste en un filtro de detección, un espejo dicroico y un filtro de detección.
El filtro de detección sirve para seleccionar la longitud de onda de excitación en el caso que se trabaje con una lámpara;
el espejo dicroico permite separar la luz de excitación de la señal fluorescente de la muestra que se quiere medir;
el filtro de detección se utiliza para seleccionar la longitud de onda fluorescente. Además se puede agregar un filtro notch centrado en el color de excitación
para minimizar el ruido. Este factor puede ser importante sobre todo cuando la señal fluorescente es muy débil o en experiencias de superresuloción
donde el ruido incide en la resolución del microscopio.
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El cubo de filtros es la parte fundamental de un microscopio de fluorescencia pues permite separar la señal fluorescente y consiste en un filtro de detección, un espejo dicroico y un filtro de detección.
El filtro de detección sirve para seleccionar la longitud de onda de excitación en el caso que se trabaje con una lámpara;
el espejo dicroico permite separar la luz de excitación de la señal fluorescente de la muestra que se quiere medir;
el filtro de detección se utiliza para seleccionar la longitud de onda fluorescente. Además se puede agregar un filtro notch centrado en el color de excitación
para minimizar el ruido. Este factor puede ser importante sobre todo cuando la señal fluorescente es muy débil o en experiencias de superresuloción
donde el ruido incide en la resolución del microscopio.
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Objetivo
La gran mayoría de los objetivos utilizados en microscopía de fluorescencia son corregidos a infinito dado que permiten disponer de toda
la óptica de detección (sean polarizadores o filtros), entre el objetivo y la lente de tubo, sin comprometer la imagen en la cámara CCD. En la actualidad existe una gran variedad de objetivos con
distintas magnificaciones (del x5 a x100), apertura numérica y medio de inmersión (aceite, agua o aire).
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La gran mayoría de los objetivos utilizados en microscopía de fluorescencia son corregidos a infinito dado que permiten disponer de toda
la óptica de detección (sean polarizadores o filtros), entre el objetivo y la lente de tubo, sin comprometer la imagen en la cámara CCD. En la actualidad existe una gran variedad de objetivos con
distintas magnificaciones (del x5 a x100), apertura numérica y medio de inmersión (aceite, agua o aire).
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Lente de tubo
La lente de tubo permite generar la imagen de fluorescencia que se enfoca en el sensor de la cámara CCD. La distancia focal
de la lente de tubo, además de la magnificación del objetivo, determinan tanto el campo de visión como el tamaño del pixel de la cámara
y la resolución del microscopio.
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La lente de tubo permite generar la imagen de fluorescencia que se enfoca en el sensor de la cámara CCD. La distancia focal
de la lente de tubo, además de la magnificación del objetivo, determinan tanto el campo de visión como el tamaño del pixel de la cámara
y la resolución del microscopio.
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Cámara CCD
La cámara CCD (o CMOS) es parte esencial del arreglo y provee la imagen de fluorescencia. Dado que la señal fluorescente es generalmente muy débil es necesaria una
cámara de alta sensibilidad y bajos niveles de ruido. Entre las cámaras más sensibles se encuentran las back illuminated que tienen eficiencias cuánticas de por arriba del 90%.
Las cámaras EMCCD (Electron Multiplying CCD) permiten reducir el ruido de lectura y digitalización a niveles despreciables.
Las refrigeradas con celdas peltier permiten bajar la temperatura del chip CCD a por debajo de los -70°, reduciendo así el ruido térmico. Otra factor fundamental es la rapidez de adquisición
que puede ser mejorada introduciendo otro chip que puede ser utilizado aún durante la lectura de la CCD (frame transfer).
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La cámara CCD (o CMOS) es parte esencial del arreglo y provee la imagen de fluorescencia. Dado que la señal fluorescente es generalmente muy débil es necesaria una
cámara de alta sensibilidad y bajos niveles de ruido. Entre las cámaras más sensibles se encuentran las back illuminated que tienen eficiencias cuánticas de por arriba del 90%.
Las cámaras EMCCD (Electron Multiplying CCD) permiten reducir el ruido de lectura y digitalización a niveles despreciables.
Las refrigeradas con celdas peltier permiten bajar la temperatura del chip CCD a por debajo de los -70°, reduciendo así el ruido térmico. Otra factor fundamental es la rapidez de adquisición
que puede ser mejorada introduciendo otro chip que puede ser utilizado aún durante la lectura de la CCD (frame transfer).
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